簡(jiǎn)化基因組測(cè)序   RAD-Seq

基于酶切的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（Restriction-site Associated DNA Sequence, RAD-Seq）是對(duì)與限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)相關(guān)的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，可大幅降低基因組的復(fù)雜度，降低建庫(kù)和測(cè)序成本，操作簡(jiǎn)便，同時(shí)不受參考基因組的限制，可快速鑒定出高密度的SNP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因的預(yù)測(cè)。RAD-Seq尤其適合于大樣本量的研究，可以為利用全基因組重測(cè)序技術(shù)做深度信息挖掘奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。RAD-Seq技術(shù)可廣泛應(yīng)用于變異檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因挖掘、群體進(jìn)化等研究，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

技術(shù)路線

技術(shù)流程

技術(shù)參數(shù)

樣品要求

一、變異檢測(cè)：

1. DNA樣品量≥ 3 ug；

2. EcoRI（GAATTC）酶切；

3. 推薦測(cè)序深度≥ 1X/個(gè)（組裝樣本的測(cè)序深度≥ 5X）。

二、遺傳圖譜：

1. DNA樣品量≥ 3 ug；

2. 測(cè)序深度：親本2-5X，子代0.8X/個(gè)（F1、F2等臨時(shí)性群體），0.6X/個(gè)（RIL、DH等永久性群體）；

3. 適用范圍：?jiǎn)伪扼w或者二倍體物種，所有作圖群體（F1、F2；RIL、DH等），群體大小在100個(gè)以上。

三、群體進(jìn)化：

1. DNA樣品量≥ 3 ug；

2. 測(cè)序深度：≥ 1X/個(gè)（組裝樣本的測(cè)序深度5X）

3. 適用范圍：?jiǎn)伪扼w或者二倍體物種中不同亞群，各亞群間劃分明顯，同一亞群內(nèi)的個(gè)體有一定代表性，每個(gè)亞群選取10個(gè)樣本左右（動(dòng)物≥ 10個(gè)，植物≥ 15個(gè)），總體不少于30個(gè)樣本。

四、樣品細(xì)則：

1. DNA樣品：請(qǐng)?zhí)峁舛龋?00 ng/μl，總量＞3μg的DNA，OD 260/280在1.8~2.0之間，并確保DNA無(wú)降解，電泳檢測(cè)無(wú)明顯RNA條帶，基因組條帶清晰、完整，主帶應(yīng)在100kb以上。若樣品中有多糖、糖蛋白的殘留，對(duì)打斷DNA樣品帶來(lái)非常大的困難，且很難去除，因此特別要求所提供的樣品不要有多糖或糖蛋白污染。

2. 植物樣品：選取植物幼嫩組織，每個(gè)樣品重量＞500 mg，干冰或者液氮保存寄送。

3. 動(dòng)物樣品：要求新鮮動(dòng)物組織，避免脂肪組織，每個(gè)樣品重量＞50 mg。對(duì)于一般物種應(yīng)挑選肝臟、腎臟、血液等組織取樣，對(duì)于珍貴物種請(qǐng)?zhí)峁┒鷺?、毛發(fā)（帶毛根）等脂肪含量較少的組織進(jìn)行取樣。為了減少個(gè)體差異對(duì)后續(xù)拼接產(chǎn)生的影響，盡量從同一個(gè)個(gè)體中取樣。若物種體積較小，從一個(gè)個(gè)體中提取的DNA量不能滿足測(cè)序?qū)嶒?yàn)所需，在保證量的前提下，應(yīng)盡量減少采樣個(gè)體的數(shù)量。提供組織樣品應(yīng)＞50 mg，盡量提供較多量，不同的物種DNA提取產(chǎn)量有差異。

4. 樣品運(yùn)輸：送樣管務(wù)必標(biāo)清樣品編號(hào)，管口使用Parafilm膜密封，樣品請(qǐng)用干冰或者冰袋運(yùn)輸。干冰運(yùn)輸時(shí)間不要超過(guò)72小時(shí)；冰袋運(yùn)輸，時(shí)間最好不要超過(guò)24小時(shí)。樣品保存期間切忌反復(fù)凍融。

常見(jiàn)問(wèn)答

1. Q：高密度SNPs標(biāo)記開(kāi)發(fā)時(shí)要考慮哪些因素？

A：高密度SNPs標(biāo)記開(kāi)發(fā)的基本條件和設(shè)計(jì)理念是所獲得的片段盡量在基因組上分布均勻，通過(guò)測(cè)定少量代表全基因組信息的序列獲得成千上萬(wàn)個(gè)SNPs標(biāo)記。首先要利用生物信息學(xué)方法對(duì)目標(biāo)物種參考基因組（或已知BAC序列）進(jìn)行系統(tǒng)分析，根據(jù)基因組GC含量、重復(fù)序列情況和基因特點(diǎn)等信息，選擇相應(yīng)的限制性酶以及測(cè)序文庫(kù)類型，以保證分子標(biāo)記的密度、均勻性、效率滿足遺傳分析和分子育種的需要。

2. Q：RAD-seq的適用范圍？

A：可用于鑒定任何物種（有無(wú)參考基因組數(shù)據(jù)均可）的遺傳圖譜、多態(tài)（親緣地理分析）、關(guān)聯(lián)、QTL定位等分析。RAD-Seq技術(shù)可廣泛應(yīng)用于變異檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因挖掘、群體進(jìn)化等研究。

3. Q：用RAD-seq研究群體進(jìn)化的優(yōu)勢(shì)是什么？

A：一般情況下，群體進(jìn)化研究涉及較大的樣本量，RAD-seq可大幅降低基因組的復(fù)雜度，降低建庫(kù)和測(cè)序成本，操作簡(jiǎn)便。另外，它不受參考基因組的限制，研究物種范圍更廣泛。RAD-Seq尤其適合于大樣本量的研究，可以為利用全基因組重測(cè)序技術(shù)做深度信息挖掘奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4. Q：有參和無(wú)參的區(qū)別是什么？

A：對(duì)于發(fā)現(xiàn)突變信息而言，有參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)和變異檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確率更高。而且，可以定位受選擇的基因，研究群體的連鎖不平衡現(xiàn)象。