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CRISPR sgRNA 文庫服務(wù)

服務(wù)簡介

CRISPR-Cas9 技術(shù)作為最被廣泛接受的基因編輯工具，具有精準(zhǔn)、廉價(jià)、易于使用的特點(diǎn)。由于基因組序列中PAM序列的廣泛存在，運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)基本能實(shí)現(xiàn)對基因組中所有基因的編輯。CRISPR文庫基于CRISPR/Cas9技術(shù)建立高通量基因篩選方案，通過微陣列技術(shù)合成高質(zhì)量寡核苷酸序列，高通量的構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒文庫，包裝慢病毒后以低MOI（通常＜0.3）感染待篩選細(xì)胞，確保一個(gè)細(xì)胞只進(jìn)入一種sgRNA，再給細(xì)胞加以篩選因素（如藥物處理、低氧處理、病毒感染或細(xì)胞本身的生存能力等），收集篩選后不同時(shí)間段（0 day/7day/14day）的細(xì)胞進(jìn)行NGS測序，正向篩選或負(fù)向篩選分析實(shí)驗(yàn)組與對照組之間sgRNA的豐度變化情況，獲得與篩選因素相關(guān)的靶基因。艾基生物整合多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，可提供CRISPR sgRNA文庫的一站式合成及基因功能篩選服務(wù)，包括快速高效地實(shí)現(xiàn)sgRNA oligo pool合成及文庫構(gòu)建，質(zhì)粒制備，病毒包裝，細(xì)胞轉(zhuǎn)染、NGS測序和數(shù)據(jù)分析。

服務(wù)流程

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服務(wù)優(yōu)勢

1、豐富的基因合成和建庫經(jīng)驗(yàn)，確保文庫的多態(tài)性和均一性, 文庫可達(dá)10⁸。

2、根據(jù)客戶自身需求選擇sgRNA表達(dá)載體，并提供轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒。

3、提供從sgRNA設(shè)計(jì)、文庫構(gòu)建到慢病毒包裝的一站式服務(wù)。

應(yīng)用案例

維莫非尼 (vemurafenib,PLX) 是一種用于治療BRAF V600突變陽性的不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的藥物，癌細(xì)胞產(chǎn)生的突變可以對該藥物產(chǎn)生抗性?？茖W(xué)家試圖找到導(dǎo)致黑色素瘤中對BRAF蛋白激酶抑制劑維莫非尼（PLX）產(chǎn)生耐藥性的基因靶點(diǎn)，以A375細(xì)胞為模型，應(yīng)用GeCKO正向選擇，確定發(fā)生敲除的導(dǎo)致抗藥性的基因，并針對新靶點(diǎn)開發(fā)藥物。

A：A375黑色素瘤細(xì)胞PLX耐藥篩查時(shí)間線

B：暴露于PLX的條件下，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)的A375細(xì)胞生長停滯，這些細(xì)胞攜帶V600E功能獲得BRAF突變

因此能夠富集一小群通過Cas9/sgRNA介導(dǎo)的編輯而變得耐藥的細(xì)胞。Vehicle是對照組

PLX處理14天后，與對照處理的細(xì)胞相比，sgRNA分布顯著不同（Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P < 10?10），并且與所有其他條件分開聚集。

作者發(fā)現(xiàn)一個(gè)小的基因集，在PLX處理14天后，靶向每個(gè)基因的多個(gè)sgRNA富集，這表明這些特定基因的丟失有助于A375細(xì)胞獲得PLX抗性。

示例圖

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