siRNA合成及靶點篩選

服務介紹  Service Introduction                                                    

        RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效特異的基因缺失性研究工具，是Andrew Fire 和Craig Mello在線

蟲中發(fā)現的一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導的基因沉默現象，幾乎存在于所有真核生物中。RNAi已經廣泛應用于各種真

核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現及藥物篩選。近年來，多種臨床試驗表明靶向致病基因的RNAi藥物具有治療困擾人類多

年疾病的巨大潛力。

        小干擾RNA（short interfering RNA，siRNA，～ 21nt dsRNA），可以引起與之序列匹配的靶基因mRNA 的降

解，從而導致細胞或機體產生基因沉默的表型。銳博生物提供人、小鼠、大鼠及其他物種的siRNA設計與合成，包括細胞

使用用標準純化siRNA、動物實驗用in vivo siRNA、化學修飾siRNA、siRNA預制文庫、定制型文庫以及普通對照和熒光

轉染對照，根據客戶需求提供從從小規(guī)模到大規(guī)模的siRNA合成服務。

        艾基生物擁有成熟高效的基因合成平臺，僅需提供目的核苷酸或氨基酸序列信息，即可人工合成任何您感興趣的基

因，包括重復、發(fā) 夾、高 GC、毒性基因等困難基因序列，完全不受基因來源限制。另可依據密碼子在不同宿主細胞的

偏愛性和不同的實驗需求，提供免費 的密碼子優(yōu)化服務，提高您下游實驗的成功率。

圖 1 siRNA的作用原理示意圖

圖 2 siRNA產品包裝盒

服務特色  Service Advantages

        常規(guī)化學合成siRNA多為19nt RNA+dTdT(3'懸垂)的RNA雙鏈分子，未經任何化學修飾

        Sense：正義鏈，RNA，序列與靶序列相同

        Antisense：反義鏈，RNA，序列與靶序列互補

        dTdT：兩端懸垂，DNA，均在3'端

        還支持各種特殊修飾或突變設計

圖 3 siRNA結構示意圖

代表性客戶文章（siRNA相關） Articles

1 Lu, Y. et al. CLP36 promotes p53 deficient sarcoma progression through suppression of atrophin-1 

interacting protein-4 (AIP-4)-dependent degradation of YAP1. 

Theranostics 12, 5051-5068 (2022). https://doi.org/10.7150/thno.72365

2 Zheng, Y. et al. A pan-cancer analysis of CpG Island gene regulation reveals extensive plasticity within 

Polycomb target genes. 

Nat Commun 12, 2485 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22720-0

3 Ye, F. et al. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells promotes c-Jun-dependent secretion 

of interleukin 8 and mediates the migration and differentiation of CD4(+) T cells. 

Stem Cell Res Ther 13, 58 (2022). https://doi.org/10.1186/s13287-022-02735-0

4 Chen, B. et al. Transmembrane nuclease NUMEN/ENDOD1 regulates DNA repair pathway choice at the 

nuclear periphery. 

Nat Cell Biol 25, 1004-1016 (2023). https://doi.org/10.1038/s41556-023-01165-1

5 Geng, Y. et al. FTO-targeted siRNA delivery by MSC-derived exosomes synergistically alleviates 

dopaminergic neuronal death in Parkinson's disease via m6A-dependent regulation of ATM mRNA. 

J Transl Med 21, 652 (2023). https://doi.org/10.1186/s12967-023-04461-4

6 Lin, X. et al. Activation of STING signaling aggravates chronic alcohol exposure-induced cognitive 

impairment by increasing neuroinflammation and mitochondrial apoptosis. 

CNS Neurosci Ther 30, e14689 (2024). https://doi.org/10.1111/cns.14689

7 Zhang, Y. et al. Glutamine suppresses senescence and promotes autophagy through glycolysis 

inhibition-mediated AMPKα lactylation in intervertebral disc degeneration. 

Commun Biol 7, 325 (2024). https://doi.org/10.1038/s42003-024-06000-3

8 Liu, Y. et al. SLC25A22 as a Key Mitochondrial Transporter Against Ferroptosis by Producing Glutathione 

and Monounsaturated Fatty Acids. 

Antioxid Redox Signal 39, 166-185 (2023). https://doi.org/10.1089/ars.2022.0203

9 Bao, J. et al. Upregulated TIMP1 facilitates and coordinates myometrial contraction by decreasing 

collagens and cell adhesive capacity during human labor. 

Mol Hum Reprod 29 (2023). https://doi.org/10.1093/molehr/gaad034

10 Hu, H. et al. Thrombospondin-1 Regulates Trophoblast Necroptosis via NEDD4-Mediated 

Ubiquitination of TAK1 in Preeclampsia. 

Adv Sci (Weinh) 11, e2309002 (2024). https://doi.org/10.1002/advs.202309002

FAQ

• 1. siRNA是什么？

   

      siRNA（small interfering RNA）是一類長度約為20-25個核苷酸的雙鏈RNA分子。它在細胞中通過與互補的mRNA

      結合并誘導其降解，從而抑制特定基因的表達。

• 2. siRNA的作用機制是什么？

      siRNA的作用機制主要包括以下步驟：

      長雙鏈RNA（dsRNA）被Dicer酶切割成21-25個核苷酸的siRNA，siRNA被整合到RNA誘導沉默復合體（RISC）中，

      在RISC中，siRNA的正義鏈被降解，反義鏈作為引導鏈，引導鏈與靶mRNA互補結合，RISC中的核酸酶切割靶

      mRNA，導致其降解，從而抑制基因表達。

• 3. siRNA有哪些應用？

   

      基因功能研究：通過特異性敲低基因表達，研究基因在細胞中的功能。

      藥物靶點驗證：用于驗證潛在藥物靶點的有效性。

      疾病治療：理論上可以沉默任何與疾病相關的基因，用于治療多種疾病。

      基因沉默工具：在基因沉默研究中被廣泛應用。

• 4. 如何設計siRNA？

   

      選擇GC含量在30%-52%的序列，避開5'和3'端的非編碼區(qū)；比對基因組數據庫，排除與其他編碼序列同源的序列；合

      成多個靶序列的siRNA，篩選出最有效的序列；設計陰性對照siRNA，確保實驗結果的可靠性。

• 5. siRNA轉染方法有哪些？

   

      常見的siRNA轉染方法包括磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE葡聚糖、機械法（如顯微注射和基因槍）和陽離子脂質體

      試劑轉染法。其中，陽離子脂質體試劑轉染法是最常用的方法。

• 6. siRNA在體內應用面臨的挑戰(zhàn)有哪些？

  
  

      穩(wěn)定性差：易被血液中的核酸內切酶水解。

      細胞膜滲透性差：帶負電荷的siRNA難以穿透細胞膜。

      脫靶效應：可能干擾與靶mRNA部分同源的其他mRNA。

      免疫反應：過長的siRNA可能激活免疫反應。

• 7. 如何提高siRNA的穩(wěn)定性和遞送效率？

  
  

      化學修飾：通過糖修飾、磷酸鹽主鏈修飾或堿基修飾提高siRNA的穩(wěn)定性；

      使用遞送系統：如納米載體、適體、多肽、蛋白質和抗體等。

• 8. siRNA與miRNA的區(qū)別是什么？

  
  

      來源：siRNA是人工合成的，miRNA是內源的。

      結構：siRNA是雙鏈RNA，miRNA是單鏈RNA。

      作用位置：siRNA可作用于mRNA的任何部位，miRNA主要作用于靶基因的3'-UTR區(qū)。

siRNA-靶基因敲低效率驗證

細胞實驗方法 Methods

轉染效率對不同的細胞株和不同的轉染試劑是不同的。我們僅以轉染試劑LipofectamineTM 2000為例說明轉染方法。為

了降低細胞密度、試劑用量，轉染效率等因素導致的孔間差異，保證實驗的可靠性和可重復性，我們建議：

        1.轉染實驗中每個轉染樣品至少設置3個復孔；

        2.轉染實驗分組設置建議：

                1）熒光對照siRNA組（檢測轉染效率）；

                2）空白對照組（不含轉染試劑和siRNA）；

                3）轉染試劑對照組（不含siRNA）；

                4）陰性對照siRNA組；

                5）陽性對照siRNA組；

                6）實驗siRNA組；

        3.接種細胞時，每孔接種的細胞數量盡量保持一致，盡量使細胞在各孔的表面平均分布。

一、轉染濃度

        1) 為了獲得最佳基因阻斷結果，每一種細胞系轉染siRNA的量都需要經過實驗確定。如果您是首次轉染您的細胞系，

推薦嘗試使用幾個 LipofectamineTM 2000的濃度，并在20-100nM范圍內改變siRNA的濃度，以確定達到最佳基因阻斷

水平所需要的條件。高濃度的 siRNA可能具有細胞系依賴性。

        2) 在30-50％細胞匯合度時進行轉染。通常基因沉默分析至少要在轉染后24-72h進行。低密度轉染細胞可以使轉染

和分析之間更長的間隙更長，從而使由于細胞過度生長造成的細胞活性損害減少到最低。根據靶基因的特性，高密度轉染

的細胞可能更加適合條件的優(yōu)化。 

        3) 不要在轉染時的培養(yǎng)基中加入抗生素，因為這將會降低細胞轉染的效率和導致細胞死亡。

        4) 為獲得更好的結果，可以使用Invitrogen的Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基在形成復合物前稀釋LipofectamineTM 2000

和siRNA?？梢允褂脽晒鈽擞浀膕iRNA幫助優(yōu)化細胞系的轉染條件。一旦確定了用來轉染的最佳條件，可以在每一次實驗

都包括熒光標記siRNA，作為轉染效率的指示劑。

二、轉染步驟

        以LipofectamineTM 2000轉染siRNA于24孔板，轉染濃度為50nM為例，其他規(guī)格容器轉染請參考表2。

        注:轉染成功是siRNA 發(fā)揮作用的前提，寡核酸轉染效率主要為細胞性質和轉染方法所決定，需要選擇對實驗細胞轉

染率高且毒性低的轉染試劑和轉染方法。

        1）接種細胞

        貼壁細胞：轉染前24h，在400uL無抗培養(yǎng)基中接種0.5-2×105個細胞，轉染時細胞融合度為50-70%。(注：鋪板時要

將細胞消化完全、混勻，避免細胞堆積生長。)

        懸浮細胞：轉染前24h，在400uL無抗培養(yǎng)基中接種0.5-2×105個細胞，轉染時細胞數量應在4-8×105/孔。 

        注：需根據細胞的增殖速度、對轉染的毒性反應以及檢測時間等調整轉染時的細胞密度，除特定實驗  (如劃痕實驗等)外，

一般以到檢測時間點時細胞未完全長滿為宜。

        2）轉染步驟

        A. 用50uLOpti-MEM稀釋siRNA(轉染細胞的終濃度為50nM)，輕輕吹吸3-5次混勻。

        B. 輕輕顛倒混勻轉染試劑，用50uL Opti-MEM 稀釋1.0uL LipofectamineTM 2000，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。

        C. 混合轉染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。

        注：混合液可室溫放置一段時間，但不宜超過 24h

        D.轉染復合物逐滴加入到24孔細胞板中，100uL/孔，前后輕搖細胞板混合均勻。

        注：轉染復合物加入至原細胞培養(yǎng)基中一般無需移除或更換，  但亦可依據具體實驗情況進行優(yōu)化

        E.細胞板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48h。轉染4-6h后可換新鮮培養(yǎng)基。

表2 使用lipofectamine2000(invitrogen) 轉染siRNA產品用量參考

V1：完全或不完全培養(yǎng)基；v2:Opti-MEM? I (無血清、無抗生素，轉染專用)

注：表中數據僅供參考，對于部分細胞類型的轉染試劑用量可進一步優(yōu)化。

        3） 效果檢測

        轉染完成后24-72h均可進行siRNA沉默效果檢測，最佳檢測時間與細胞類型，轉染試劑，檢測目的等相關。

        1）RNA水平的檢測：mRNA是檢測siRNA 沉默效率的最佳指標，siRNA轉染后24-72h即可檢測到靶基因mRNA表達明

顯降低，檢測方法宜采用qPCR檢測方法。

        注：引物設計質量很重要，需要確保檢測引物有效性。

        2）蛋白水平的檢測：蛋白是RNAi沉默效率的重要指標，其檢測手段主要為Western Blot等。檢測時間受細胞內蛋白質

表達量、半衰期等因素的影響，一般為 48-96h。

        3）功能篩選：應用EdU細胞增殖、EdUTP細胞凋亡等方法進行細胞功能篩選。

        對照轉染圖：

        敲低效率驗證：