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A15:因?yàn)橐锛兌炔豢赡苁?00%，因此，挑選克隆時(shí)，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時(shí)，請(qǐng)重新挑選一個(gè)克隆測(cè)序，會(huì)得到正確的結(jié)果。如果挑選2 ~ 3個(gè)克隆測(cè)序情況還沒改觀，我們會(huì)免費(fèi)重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。如進(jìn)行索賠時(shí)，按國(guó)際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價(jià)格范圍之內(nèi)。

A14:不能。因?yàn)镋B是通過(guò)嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過(guò)自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù)EB染色帶的亮度來(lái)對(duì)合成的DNA進(jìn)行定量。

PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮:引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大；引物本身是否有立體結(jié)構(gòu)；PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作；PCR儀是否工作正常；PCR反應(yīng)條件是否合適；如果一切正常，還無(wú)法解決問題時(shí)，我們可以免費(fèi)重新合成引物。

對(duì)引物進(jìn)行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現(xiàn)多條泳帶，更無(wú)法用Agarose電泳進(jìn)行定量了。

由于核酸在260nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時(shí)，常用A260/A280比值來(lái)評(píng)價(jià)核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時(shí)的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個(gè)堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的引物的A260/A280比值也不同，例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時(shí)，該比值會(huì)大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來(lái)判斷引物的純度。

沒有，5和3末端均為-OH基。如需要加磷酸基團(tuán)，則需要使用修飾合成增加磷酸化。

實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,<12個(gè)堿基的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，>60個(gè)堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒有雜帶，說(shuō)明純度是好的(有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì)有條帶，乃是引物二級(jí)結(jié)構(gòu)條帶)。

通常在合成長(zhǎng)鏈引物時(shí)，試劑的加入量要比短鏈引物多很多，尤其是大于90bp以上的引物，由于成本的增加，從而導(dǎo)致價(jià)格也要增加。

150堿基以下。

1個(gè)OD值的Oligo的重量約為33 μg，而每個(gè)堿基的平均分子量一般按330道爾頓進(jìn)行計(jì)算。因此， 合成oligo的nmol數(shù)一般按以下公式粗略地計(jì)算： nmole數(shù)=(OD值x33μg)/(堿基數(shù)x330)x1000=OD值/堿基數(shù)x100如果需要計(jì)算合成DNA的精確濃度，請(qǐng)按以下公式進(jìn)行計(jì)算： nmole數(shù)=(OD值x1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]

用紫外分光光度計(jì)在260nm波長(zhǎng)測(cè)定溶液的吸光度來(lái)定量，測(cè)定時(shí)溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會(huì)有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色皿中測(cè)定其吸光度，即為所測(cè)體積的OD值，進(jìn)而可以計(jì)算出母液的OD值。

沒有溶解的引物非常穩(wěn)定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲(chǔ)存液，分裝數(shù)管保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復(fù)多次凍融會(huì)降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

我們的合成報(bào)告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實(shí)驗(yàn)需要加入適量的無(wú)核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，防止開蓋時(shí)引物散失。

純化方式 詳細(xì)說(shuō)明 C18 柱脫鹽 又稱為簡(jiǎn)易反相柱，對(duì)DNA 有特異性吸附，可被有機(jī)溶液洗脫，但不會(huì)被水洗脫，因此能有效地去除鹽分。 R-PAGE 基于特異或反向?qū)游龇? 從合成好的產(chǎn)物中去除失敗序列，適于35 個(gè)堿基以下的引物。 PAGE 純化 PAGE 純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)引物DNA 進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。 HPLC 純化 HPLC 純化是使用高效液相色譜的原理，對(duì)引物DNA 進(jìn)行純化。該方法用于分離純化或分析時(shí)能達(dá)到很高的純度和靈敏度。常用的有離子交換HPLC 和反相HPLC。

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無(wú)論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。（1） 去保護(hù)：加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護(hù)基團(tuán) DMT ，獲得游離的 5'- OH；（2） 耦合：同時(shí)加入活化劑和新的堿基，新的堿基 5'- OH仍然被 DMT 保護(hù)，3' 端被活化與溶液中游離的 5'- OH發(fā)生耦合反應(yīng)；（3） 封閉：耦合反應(yīng)中極少數(shù) 5'- OH沒有參加反應(yīng) ，用封閉試劑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)；（4） 氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩(wěn)定的核苷磷酸酯。合成后處理：切割與脫保護(hù)基：將合成好的寡核苷酸…