DNA雙鏈斷裂 (DNA double-strand break, DSB) 是一種常見且高度有害的DNA損傷形式，嚴重威脅著基因組穩(wěn)定性和細胞存活。DSB修復缺陷或失調與腫瘤、衰老以及免疫缺陷等密切相關。非同源末端連接（Non-homolouous end joining, NHEJ）和同源重組（Homologous recombination, HR）是DSB修復的兩條主要通路。一般地，HR被認為是DNA高保真的修復方式，但在特定情況下，如對于富含重復序列的異染色質來說，HR修復則容易造成非等位基因間的同源重組（non-allelic homologous recombination, NAHR），從而導致染色體的重排與畸變。因此，細胞如何調控和選擇這兩種途徑對DNA修復的精確性以及基因組穩(wěn)定性的維持至關重要。DNA雙鏈斷裂末端的加工模式決定了NHEJ/HR修復途徑的選擇。此外，不同的染色質狀態(tài)以及核內空間分布也影響著DSB修復，比如異染色質核纖層關聯(lián)域（Lamina-associated domains，LADs）分布在核周（nuclear periphery），更傾向于原位的NHEJ修復。但是，如何根據不同的染色質狀態(tài)以及核內空間分布實現(xiàn)不同的DSB末端加工和修復途徑的選擇，目前研究仍然知之甚少。

        2023年6月15日，中山大學生命科學學院松陽洲課題組與孫逸仙紀念醫(yī)院合作在Nature Cell Biology雜志發(fā)表了題為Transmembrane nuclease NUMEN/ENDOD1 regulates DNA repair pathway choice at the nuclear periphery的研究成果。其中艾基生物合成生物學平臺為本課題提供siRNA合成等服務。

        PARP抑制劑（PARPi）是臨床上治療BRCA突變乳腺癌和卵巢癌的一線靶向藥物，可以通過合成致死的方式特異性殺死BRCA突變的腫瘤細胞。但是，如果腫瘤細胞中NHEJ的某些關鍵調控因子如53BP1、RIF1等發(fā)生缺失或突變，則會導致HR通路重新激活，從而引起對PARPi的抗藥性。利用這個特性，可以通過全基因組水平的PARPi耐藥篩選，尋找一些能調控NHEJ/HR修復通路選擇且未知的NHEJ調控因子。   NUMEN的核膜定位為核周分布的LADs進行NHEJ修復創(chuàng)造了條件，有利于基因組穩(wěn)定性的維持。另外，NUMEN的缺失也會導致BRCA1突變的腫瘤細胞對PARPi產生耐藥。NUMEN的發(fā)現(xiàn)解釋了細胞如何根據不同染色質狀態(tài)以及核內空間分布選擇最有利的DSB修復方式，以最大程度維持基因組的穩(wěn)定性。

        研究人員首先通過全基因組的CRISPR敲除篩選，得到一系列可造成PARPi耐藥的候選基因，其中包括已知的耐藥基因如53BP1、RNF168與SLFN11等，證明了篩選結果的可靠性。其中，ENDOD1作為一個潛在的核酸酶，在篩選結果中排名靠前且在DNA損傷修復中的作用幾乎未見報道，于是研究人員重點選取了ENDOD1作為實驗研究的對象。基于本研究中發(fā)現(xiàn)ENDOD1的一些新特征，研究人員將其重新命名為NUMEN（Nuclear membrane endo/exonuclease）。

        研究人員接著驗證了NUMEN敲除可導致多種BRCA1突變的腫瘤細胞對PARPi耐藥，其缺失也可導致腫瘤細胞對多種DNA損傷藥物更為敏感。接下來，研究人員通過體外酶切實驗鑒定了NUMEN蛋白的酶活特性，發(fā)現(xiàn)NUMEN同時具有核酸內切酶和3’→5’外切酶活性，能特異切割ssDNA以及3’ overhang DNA，產生1-4 nt 5’ overhang末端。有趣的是，在相同的反應濃度下，NUMEN沒有顯示出對雙鏈DNA內部和RNA底物有顯著的切割活性。NUMEN切割雙鏈DNA末端產生的1-4 nt 5’ overhang已被證實比3’ overhang DSB具有更高的NHEJ效率，研究人員推測NUMEN參與細胞內NHEJ修復的過程。

        進一步，研究人員確認NUMEN敲除可以使細胞核內3’ overhang DNA累積增加，HR總體水平升高，NHEJ通路受到破壞；過表達NUMEN則有相反的效果。對于TRF2敲除的細胞，NUMEN失活導致NHEJ依賴的端粒融合比例下降。另外，NUMEN缺失也可以重新激活BRCA1敲除細胞的HR修復通路，這是BRCA1突變細胞產生PARPi耐藥的基礎。通過以上實驗，研究人員證實了NUMEN可以促進NHEJ并抑制HR修復，通過拮抗3’ overhang形成參與調控DNA雙鏈損傷修復途徑的選擇。

        免疫熒光結果顯示，NUMEN定位于細胞核膜。利用鄰近蛋白標記技術（BioID），研究人員進一步鑒定了NUMEN的相互作用蛋白組。除了與NHEJ通路的關鍵蛋白DNA-PKcs相互作用外，大量的核膜蛋白包括LAD相關蛋白也在質譜中富集。運用超分辨顯微鏡進行活細胞追蹤發(fā)現(xiàn)，一部分細胞核內部的DSB損傷點可以動態(tài)地移到核膜與NUMEN發(fā)生互作；而核周區(qū)域產生的DSB也能在核膜附近進行原位修復。那么，作為一個核酸酶，NUMEN錨定在核膜的意義是什么呢？結合LADs更傾向于在原位進行NHEJ修復，研究人員猜測NUMEN與LADs的損傷修復相關。為此，研究人員構建了用于追蹤LADs的m6A-Tracer系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)NUMEN與LADs存在很好的共定位。利用zeocin誘導DSB形成，研究人員發(fā)現(xiàn)NHEJ標志蛋白53BP1和RIF1在核周與NUMEN的共定位比HR標志蛋白更多，而NUMEN敲除后53BP1的核周分布則明顯減少。利用CRISPR/Cas9對分布在LADs上的LINE重復序列進行切割，研究人員發(fā)現(xiàn)NUMEN敲除導致LADs上的DSB修復效率顯著變慢。

        最后，研究人員通過分析TCGA數據庫發(fā)現(xiàn)，NUMEN低表達的乳腺癌樣本中，與基因組瘢痕（Genomic Scar）相關的幾種特征都有所升高；而且NUMEN表達水平與多種腫瘤的基因組拷貝數變異（CNV）呈顯著負相關。這提示NUMEN對基因組穩(wěn)定性的維持起著重要的作用。另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，NUMEN與BRCA1的表達水平也有著微妙的平衡關系，我們猜測NUMEN可能通過避免高重復序列的異染色質間發(fā)生NAHR繼而對基因組起保護作用。

        綜上所述，該研究揭示了NUMEN作為一個新發(fā)現(xiàn)的核膜錨定核酸酶，可以對DSB末端和3’ overhang DNA進行切割，產生有利于NHEJ修復的底物，并調控NHEJ/HR通路的選擇。NUMEN的核膜定位促進了LADs進行NHEJ修復，有助于基因組穩(wěn)定性的維持。

NUMEN的作用機制模型

論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41556-023-01165-1