国产在线观看三级中文_日韩亚洲精品不卡在线_日韩国产成人软件在线观看_香蕉色香蕉在线视频_日韩综合无码性爱视频播放_亚洲日韩 V天堂_色欲国产高清一区二区三区_亚洲中文字幕无码永久不卡_国产做床爱无遮挡免费视频_手机看片日韩国产欧美高清

出于保密原則我們測序樣品只保留一個月，所以若要再測序，請抓緊時間，否則只有重新送樣。

由于原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)如發(fā)卡和回文結(jié)構(gòu)，有時會出現(xiàn)突然信號減弱或消失；有時測序根本不能進(jìn)行下去， DNA 堿基排列并無特別異常，可能是 DNA 整體出現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，反應(yīng)無法進(jìn)行。

PCR 產(chǎn)物 150bp 以下的純化和定量都有一定困難，用于測序的 PCR 產(chǎn)物一般不低于150 bp 長度。一個150 bp 的 PCR 產(chǎn)物用于測序，去掉兩個引物的序列大約40 到50 bp ， 再加上測序起始端的一些讀不好的堿基，真正能夠得到的有用序列不過幾十堿基。這只是最理想的假設(shè)，這么短片斷測序失敗的幾率非常大，因此只能克隆后再進(jìn)行測序。

由于 G/C 連續(xù)結(jié)構(gòu)有時會造成反應(yīng)中途無法正常進(jìn)行，如果結(jié)構(gòu)在引物下游近處，反應(yīng)只有一小段的信號，有時甚至反應(yīng)根本沒信號。對于這種情況，本身就潛在不確定性的測序，有很大的失敗因素。

對于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 α， DH1 、 和 C600 E.coli 菌株也可， XL1‐Blue E.coli 菌株也不錯，但其生長過慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于產(chǎn)生大量的碳水化合物（即糖），而應(yīng)當(dāng)盡量避免使用；其它宿主菌可能會對測序造成影響。

并不是能做 PCR 反應(yīng)的引物都能測序，測序所用引物要求較高,必須與模板完全匹配（有時 5' 端可以有個別堿基的簡并），引物長度一般為20 個堿基左右、 GC 含量適中，而且用于測序的引物一定要足夠純。

這種情況一般表現(xiàn)為 A 、 T 連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測序結(jié)果出現(xiàn)套峰，是樣品的內(nèi)在原因。這類問題我們應(yīng)該同正常測序一樣，給客戶報告，反應(yīng)按正常收費(fèi)。

測序結(jié)果表現(xiàn)為套峰，測序反應(yīng)信號很好，測序結(jié)果雜亂,即同一個位置有二個峰。原因可能有：樣品并非單一模板、 PCR 產(chǎn)物中有雜帶、質(zhì)粒為雙克隆產(chǎn)物、引物特異性不高，有兩個結(jié)合點(diǎn)， PCR 產(chǎn)物電泳時看不出，但測序結(jié)果能清楚地說明這點(diǎn)。

測出來的結(jié)果與您預(yù)期的方向并不一致,可能是片斷插入方向是非定向的，這在 PCR 產(chǎn)物 T/A 克隆中較常見。有時，客戶要求的測序引物離克隆位點(diǎn)較近，如果反向引物相對克隆位點(diǎn)較遠(yuǎn)，為得到更好的結(jié)果，我們會選擇反向引物測序，若是這種情況，用看圖軟件 Chromas 可以把圖反轉(zhuǎn)過來，就可得到正向序列。

菌體的一般形態(tài)有、菌液，平板培養(yǎng)菌、穿刺培養(yǎng)菌，甘油保存菌等。我們建議客戶所送的形態(tài)以方便且不易受污染為準(zhǔn)則，推薦穿刺培養(yǎng)菌。 上?？蛻粲眠^夜培養(yǎng)好的菌液2 ml。

由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一種潛在的抑制物, DNA 的測序反應(yīng)也是 Taq 酶的聚合反應(yīng)，需要一個最佳的酶反應(yīng)條件,因此 DNA 測序樣品溶解時，最好用滅菌水溶解。

如果在您認(rèn)為應(yīng)該出現(xiàn)雜合信號的位置上只出現(xiàn)單一的信號，那么可能是您樣品突變的模板與正常的模板的比例沒達(dá)到可以測出的濃度。測序反應(yīng)的信號強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很低，儀器會自動將它作為背景信號了，很難檢測出來。只有當(dāng)測序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強(qiáng)度一般是不一樣的，這樣即使突變的模板所占的比例較高時，也不一定能準(zhǔn)確檢測到突變的存在，因?yàn)?，測序儀是主要用來測序正常的堿基序列的，軟件分析結(jié)果時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。尊重結(jié)果，我們是不會人為將出現(xiàn)…

PCR 產(chǎn)物克隆到載體中進(jìn)行測序，有兩個方面可能序列有變化：首先， PCR 擴(kuò)增過程中可能產(chǎn)生錯配。將片段克隆到載體中也有可能發(fā)生突變；其次，測序的準(zhǔn)確率并非100%。

原因可能有： 樣品個體之間的差別、測序準(zhǔn)確率的問題，自動測序儀分析序列的準(zhǔn)確并非100%，建議至少測一次雙向，通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。當(dāng)然盡管我們有時做了最大努力，但還是保證不了和文獻(xiàn)序列完全一致，但我們測序報告是客戶樣品序列的真實(shí)結(jié)果。

序列圖的背景雜帶是由熒光染料引起，如果太強(qiáng)會影響測序結(jié)果，要看信噪比，我們給的結(jié)果信噪比大都在98%以上。

首先，我們會核實(shí)給您的測序結(jié)果是否對應(yīng)您的樣品編號，如果對應(yīng)的是您的樣品，由于不知您的實(shí)驗(yàn)背景，測得的序列是否與您預(yù)想的結(jié)果一致我們無法判斷，我們能做到的是檢查發(fā)送給您的測序結(jié)果和您提供來的樣品是否一致。

可能的原因同上，您克隆的酶切位點(diǎn)距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到酶切位點(diǎn)。通常我們會盡量選擇距離酶切位點(diǎn)遠(yuǎn)點(diǎn)的引物，當(dāng)然，若是樣品出現(xiàn)意外原因，如空載、載體自連等，克隆的酶切位點(diǎn)也是看不到的。

如果找不到測序所用的引物序列。這是正常的，因?yàn)橐锉旧硎遣槐粯?biāo)記的，所以在測序報告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的擴(kuò)增引物，可能是您克隆的酶切位點(diǎn)距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到擴(kuò)增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此時需找引物的互補(bǔ)序列。

由于測序反應(yīng)的信號是逐漸減弱的，所以序列末端的信號會很弱，峰圖自然就會雜亂，加上測序膠的分辨率問題，如果堿基分不開，就會產(chǎn)生 N 值，正常情況下ABI377 測序儀能正確讀出500 個堿基的有效序列。

這主要是因?yàn)闅埓娴娜玖蠁误w造成的干擾峰所致，該干擾峰和正常序列峰重疊在一起；另外，測序電泳開始階段電壓有一個穩(wěn)定期，所以經(jīng)常有20‐50 bp 的緊接著引物的片段讀不清楚，有時甚至更長。